地中海贫血症
正常人的血红蛋白珠蛋白由四条以及四种肽链组成，这四种肽链分别是α、β、δ、γ。例如血红蛋白A(HbA)是α2β2，占成人血红蛋白的98％；血红蛋白A2(HbA2)是α2δ2，占成人血红蛋白的2％；血红蛋白F(HbF)是α2γ2，仅存在于胎儿血液中。缺乏α链称为α-地中海贫血，缺乏β链称为β-地中海贫血，缺乏δ链称为δ-地中海贫血，缺乏γ链称为γ-地中海贫血，以α和β地中海贫血最为常见。
α-珠蛋白基因簇位于人体16号染色体短臂一区三带（16p13.3），含有一个胚胎期表达的基因，两个胎儿期和成人期表达的基因，两个假基因和两个疑似珠蛋白的基因，主要相关的是HBA1和HBA2基因，这两个基因完全相同，均编码血红蛋白α-链，即一对16号染色体上共4个编码α-链的HBA基因。在α-地贫患者中，90%由于等位基因缺失引起，另有10%由点突变或者其它突变引起。
胚胎植入前基因检测方法
在胚胎植入前基因检测中，对染色体进行测序的分析方法已逐渐取代阵列CGH的方法。早期的阵列使用BAC探针，该探针与活检切片的全基因组扩增(WGA)DNA杂交，总成本是WGA过程、荧光标记以及阵列载玻片和试剂的组合。主要设备包括杂交和玻片清洗系统以及中高分辨率扫描仪，具体取决于所选的阵列系统。虽然对于许多大中型实验室来说是可以承受的，但对于较小的实验室来说，仪器设备和维护成本往往令人望而却步，因此非整倍体(PGT-A)的植入前基因检测总体上仍然是一个昂贵且受限的过程。随着NGS方法的出现，分析胚胎的耗材成本显著降低（低于美元），使PGT-A在常规IVF筛查中得到更广泛的应用。虽然阵列或NGS的PGT-A起点都包括WGA的某些方面及其试剂成本，但与阵列CGH相比，NGS的其他技术要求和测序成本有所降低。然而，仪器平台采购的支出有所增加。虽然许多较大的平台因其减少样品处理、半自动化的潜力和整体降低试剂成本的优势而迅速转变为基于测序的方法，但较小的团体再次面临高昂的资金成本或将分析外包给测序服务供应商是唯一的其他选择。
在过去几年中，DNA测序技术的下一个时代，即第三代测序(TGS)，在染色体分析的许多不同领域逐渐被使用。这些技术中最常见的是纳米孔测序，这种测序可以以中等的每次运行成本对长片段DNA进行快速测序，这使得它们对染色体组装特别有用。一些前期研究已经确定三代测序可用于研究染色体重排、基因融合和/或涉及DNA缺失或插入的情况等染色体结构变异情况。
基于此、医院第一医学中心妇产科以医院生殖医学与遗传中心联合团队使用来自已知染色体状态的胚胎的DNA作为模型来探索使用纳米孔测序系统在更高的测序深度分析更长的基因组片段的可行性，研究结构重排的细节，以及在移植前分析胚胎染色体平衡的任何潜在效用。研究论文题目为“Third-generationsequencing:anyfutureopportunitiesforPGT?”，发表在JournalofAssistedReproductionandGenetics上。
材料和方法
1.样本来源：
DNA来源是先前经过PGT-SR、PGT-A和PGT-M分析的胚胎，被认为不适合做胚胎移植的。因为仍然需要基因组扩增，所以选择了没有嵌合现象的纯合子的整个胚胎，纯合胚胎也为进行详细结构和倍性分析提供了一个很好的模型。
胚胎最初来自两对做PGT的夫妇：一对夫妇通过PGT-M检测都是具有已知的α-地中海贫血基因的携带者，对胚胎进行PGT-M检测、发现胚胎会导致α-地贫，因此不适合移植。另一对夫妇的其中一个是相互易位的携带者t(1,18)(q42,q12.3)。来自易位夫妇的胚胎通过PGT-SR进行检测，被鉴定为具有由相互易位的减数分裂不分离引起的部分染色体非整倍体，并且包括与NGS易位分析一致的全染色体非整倍体变异。这对夫妇的胚胎还含有一个与常见的α-地贫缺失相关的微缺失，该缺失通过PGT-M与GAP-PCR都检测到了。
2.胚胎DNA文库的生成
多重置换扩增(MDA)是许多实验室使用的首选方法，因为它能够可靠且均匀地将pg量的DNA扩增到ug水平。最终产物以30-50Kb的表观大小在琼脂糖凝胶上运行。选择已知染色体特征的整个胚胎（估计每个有80-个细胞）而不是较小的活检片段，以避免在其他PGT活检研究中可能经常出现的嵌合体漏检的现象，同时仍然利用基因组扩增过程。几项研究表明，活检和整个胚胎在主要染色体上是一致的，而它们可能因为嵌合体水平、片段变化和低至中等水平全染色体嵌合体而异。每个胚胎都去除了透明带，并在试管中用PBS清洗，然后裂解细胞、扩增建库并进行纳米孔测序。
主要结果
1.纳米孔测序结果
每张芯片测序一个样本、基因组平均覆盖深度为5X-15X。每个完整胚胎的纳米孔测序染色体分析显示与之前从活检样本中获得的基于PGT-M和基于NGS的PGT-SR结果完全一致、结果如下表所示。
2.α-地贫缺失分析
通过GAP-PCR和NGS诊断的病例一的胚胎B2和B3患有α-地贫，纳米孔测序数据通过与参考基因组进行比对、与参考基因组HBA基因处重叠的~14kb的区域中没有reads、而在视觉上得到证实。相比之下，对于不相关的病例二（胚胎L3、L4、L5和L10），在这个缺失间隔内有相对一致的reads分布，证实了测序数据中预期的正常纯合胚胎、正常的HBA序列的存在（如下图a所示）。HBA缺失区间的上游和下游约1Mb的序列检查确定了附近的多态性STR序列D16S（如下图1b所示）。该序列是HBA基因缺失的潜在连锁多态性标记、以前曾用于辅助诊断有α-地中海贫血风险的胚胎。
图1α地贫HBA基因座的缺失和STR定位
3.易位连接断点分析
基于来自病例二的不平衡胚胎的纳米孔测序数据，识别出包含实际染色体1和18断点区域的reads。更精细的序列分析确定了染色体1和18上的精确断点坐标（表1）。断点区域与亲本易位携带者的细胞遗传核型分析中鉴定的位置一致（如图2所示）。
图2相互易位的断点连接圆图
4.染色体分析
每个纳米孔测序芯片都实时获取测序数据，进入纳米孔的分子的任意性使得这种随机读取数据具有可行性，最终序列文件编号与孔捕获的原始时间相关。随机片段序列集是通过对所需片段编号的顺序文件进行有序分析来实现的。这样做的目的是研究测序数据量与可分析染色体倍性之间的关系。结果表明只需,个reads（总reads数的约5%），就可以进行简单的染色体倍性分析。通过,个reads（总reads数的约10%）实现了更稳定和可重复的染色体倍性分析。每个胚胎的预期常染色体拷贝数显示出所有重复分析的高度稳定性。在分辨率方面，1q42qter(4.5Mb)和18q12.3qter(32.5Mb)不平衡易位以及22号染色体单体都清晰可见，并且在三个重复中可重复识别（如下图所示，选择示例胚胎B2和L4）。
图3三代测序染色体分布图
讨论
对于已知具有纯合HBA基因缺失的两个胚胎，使用纳米孔进行深度测序（5-15X）能够观察到HBA基因区域~14kb中没有DNA序列片段，表明纯合缺失。另外非缺失区域的一个例子，来自无关夫妇的其他胚胎显示出跨越整个HBA基因座的序列片段，表明基因区域是完整的。对于其他常染色体，reads区域的比例相同，证实纳米孔测序可以提供简单但有效的非整倍体筛选检测。由于纳米孔测序能够在扩增的DNA中识别出这种大小的纯合缺失，因此可以考虑将其直接用于PGT-M检测，或者可能用于涉及足够大的致病微缺失或微重复的类似情况。例如，除了本文分析的α-地贫缺失之外，纳米孔测序也可能同样适用于其他大HBA缺失的PGT-M，例如在α-地中海贫血中常见的–THAI、–FIL和–MED缺失。
对于常规的PGT-A检测，简单的,个reads的低通量数据分析就可以可重复的识别出平衡和不平衡染色体，因此可以实现多个样品在单张芯片混样运行，大大节省了成本支出。
来自易位夫妇的胚胎也清晰地证明，通过深度测序，能够直接识别实际的染色体断点以及周围的DNA序列，因此，通过测序从正常人群中识别出平衡易位携带者。然而，对每个胚胎进行这种深度测序会导致每个测试胚胎的成本相对较高。
在实际易位检测中，常规的检测方法还是PCR检测，常规PCR检测可以显著降低检测的成本。这对易位夫妇的PGT检测中使用了PCR检测方法，但由于使用了常规NGS测序，因此很难找到易位断点区域的序列，需要精确定位来自载体亲本的随机片段化基因DNA，约3kb长，以初步确定近似的易位断点，然后将该信息用于PCR引物开发。纳米孔测序提供的长读序列方法有助于快速识别断点，因此如果有需要，可以简化任何基于PCR检测的特定片段引物设计。
纳米孔测序还能够确定感兴趣基因附近的潜在连锁多态性标记。分析HBA区域附近的reads能够识别多态性STR标记，即D16S，以前曾用于辅助诊断有α地中海贫血风险的胚胎。因此，对于过去进行的许多困难的PGT-M病例检测，纳米孔测序将使选择合适的连锁多态性标记和设计PCR引物更加简单。
纳米孔测序系统能够进行详细的胚胎分析和更直接的PGT-A检测。通过使用reads读数的不同子集，证明任何常规的简单整倍体检测都需要少至,条reads。由于这仅占测序数据量的5%，因此可考虑不同样本进行混样建库测序，为常规胚胎PGT-A提供了一种成本相对较低的方法。在需要高分辨率的情况下，可以混样更少的样本。这种通用的分析方法意味着即使是小型诊所也可以通过深度测序对特定病例进行有效的检查，以获得所需的信息，然后为PGT设置特定的检测，或者只是使用胚胎的深度测序作为检测。
由于每个样本测序成本低、结果质量好以及工作流程相对简单，NGS在世界大部分地区基本上取代了FISH和阵列CGH用于PGT-A检测。然而，要更广泛地使用，特别是对于中小型诊所，一个很大的障碍是测序所需的NGS设备的初始成本和持续维护成本。在只有低到中等PGT-A医院中，NGS医院自己检测变得昂贵—通常是令人望而却步。而纳米孔测序系统的硬件成本与NGS以及另外一个三代测序平台PB相比要便宜很多。纳米孔测序和PB平台的运行耗材成本相似，目前每次运行~0美元。该仪器的简单性意味着它可以在普通笔记本电脑上运行，从而进一步减少资本支出。扩大到非常大的规模确实涉及资本支出，但它仍然只是NGS基础仪器价格的一小部分。实验室技术技能要求在所有PGT应用技术中都是相似的，甚至更简单。
参考文献：
Liuetal.,Third-generationsequencing:anyfutureopportunitiesforPGT?JournalofAssistedReproductionandGenetics.
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